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溶液顏色檢查是藥物的物理特性檢查的常規(guī)檢查項，關(guān)于溶液顏色檢查法，各國藥典均有進(jìn)行描述，其中有一些相同的地方，但是也存在一些差異。下面就通過對比中國藥典、美國藥典、歐洲藥典及日本藥典中的溶液顏色檢查法，對各國的溶液顏色檢查規(guī)范進(jìn)行梳理，方便大家引用參考。
檢查方法：關(guān)于溶液顏色檢查，中國藥典和美國藥典均給出了三種方法，歐洲藥典和日本藥典只有目視法。詳見下表。
藥典 | 檢查方法 | 參考章節(jié) |
中國藥典 | 方法1：目視法 方法2：紫外-可見分光光度法<通則0401> 方法3：色差計法 | 中國藥典2020， 0901溶液顏色檢查法 |
美國藥典 | 方法1：目視比色法 方法2：分光光度法<857> 方法3：比色法 | USP，<630>VISUAL COMPARISON <631>COLOR AND ACHROMICITY COLORIMETRIC SOLUTIONS (CS) <1601>COLOR—INSTRUMENTAL MEASUREMENT |
歐洲藥典 | 目視法 | 2.2.2. DEGREE OF COLORATION OF LIQUIDS |
日本藥典 | 目視法 | 2.65 Methods for Color Matching |
在上述的溶液顏色檢查方法中，目視法依賴于人眼的主觀觀察，而分光光度法、色差計法及美國藥典中的比色法（色差計法）則是屬于儀器測量的范疇。
目視法
首先我們來歸納一下四大藥典中目視法當(dāng)中的相似與區(qū)別。
藥典 | 原始溶液 | 比色液的色調(diào)—色號 | 評判“無色" |
中國藥典 | 重鉻酸鉀溶液 硫酸銅溶液 氯化鈷溶液 | 綠黃色/黃綠色/黃色/橙黃色/橙紅色/棕紅色—0.5/1/2/3/4/5/6/7/8/9/10號 [每個色調(diào)配置11個色號] | 顏色與水或所用溶劑相同，則判定為“無色"，顏色不深于色調(diào)0.5號標(biāo)準(zhǔn)比色液判定為“幾乎無色" |
美國藥典 | 氯化鈷溶液 硫酸銅溶液 三氯化鐵溶液 | 色號A-T [一共20個色號] |
無說明 |
歐洲藥典 | 三氯化鐵溶液 氯化鈷溶液 硫酸銅溶液 | B/BY/Y/GY/R（棕/棕黃/黃/黃綠/紅）—B1-B9/BY1-BY7/Y1-Y7/GY1-GY7/R1-R7 [一共37個色號] | 如果溶液的外觀為水，顏色不比參考溶液B9強(qiáng)烈，則溶液被定義為無色 |
日本藥典 | 氯化鈷溶液 硫酸銅溶液 三氯化鐵溶液 | 系列1；色號A-T [一共20個色號] 系列2：B/BY/Y/GY/R（棕/棕黃/黃/黃綠/紅）—B1-B9/BY1-BY7/Y1-Y7/GY1-GY7/R1-R7 [一共37個色號] | 如果溶液的外觀為水，顏色不比參考溶液B9強(qiáng)烈，則溶液被定義為無色 |
從以上各大藥典的比色液的原始溶液的配置情況來看，四大藥典中均選擇了硫酸銅溶液作為藍(lán)色原始溶液、氯化鈷溶液作為紅色原始溶液。四大藥典在黃色原始溶液選擇的化學(xué)試劑有區(qū)別，中國藥典選用了重鉻酸鉀溶液，而美國/歐洲/日本藥典均選用三氯化鐵溶液作為黃色原始溶液。
而用作參考用的比色液，中國藥典中涉及到的比色液的色號是最多的（共66個），日本藥典則綜合了歐洲藥典與美國藥典中的比色液配置方式以及命名方式。
藥典 | 所需裝置 | 取樣量 | 檢查方法 | ||
中國藥典 |
25 mL那氏比色管 |
10 mL | 兩管同置于白色背景上，自上向下觀察；或同置于白色背景前，平視觀察，供試品管呈現(xiàn)的顏色與對照管比較，不得更深 | ||
美國藥典 | 應(yīng)使用內(nèi)徑、樣品溶液深度和所有其他方面盡可能匹配的顏色對比管。 | 供試品溶液與對照比色液的體積一致 | 管子應(yīng)該在白色光背景下向下觀察。如果需要，且實驗條件一致，可使用從管底部下方引導(dǎo)的光源 | ||
歐洲藥典 | 方法1： | 外徑為12 mm的無色透明中性玻璃管 | 2.0 mL | 比較溶液在漫射日光下的顏色，在白色背景下水平觀察 | |
方法2： | 無色透明中性玻璃管，底部平坦，內(nèi)徑為 15 mm至25 mm | 溶液的深度為40 mm | 比較溶液在漫射日光下的顏色，在白色背景下垂直觀察 | ||
日本藥典 | 使用系列1比色液 | 那氏比色管 | 供試品溶液與對照比色液的體積一致 | 白色背景下橫向觀察 | |
使用系列2比色液 | 方法1： | 外徑為12 mm的透明和無色玻璃試管 | 2.0 mL | 在白色背景的散射光下橫向觀察 | |
方法2 | 內(nèi)徑為15-25 mm的透明無色平底試管 | 溶液深度為40 mm | 在白色背景的散射光下垂直觀察 | ||
在上表格中已經(jīng)給出了四大藥典中的目視法檢查溶液顏色的實驗操作方法，但在對于評判結(jié)果的注意事項，中國藥典和美國藥典也給出了一些聲明。《中國藥典0901溶液顏色檢查法》章節(jié)中指出：如供試品管呈現(xiàn)的顏色與對照管的顏色深淺非常接近或色調(diào)不*一致，使目視觀察無法辨別兩者的深淺時，應(yīng)改用第三法（色差計法）測定，并將其測定結(jié)果作為判定依據(jù)。美國藥典<631>COLOR AND ACHROMICITY章節(jié)中指出：Liquids should be compared in matched color-comparison tubes, against a white background. If results are found to vary with illumination, those obtained in natural or artificial daylight are to be considered correct. Instead of visual determination, a suitable instrumental method may be used. （液體應(yīng)在對應(yīng)的比色管中與白色背景進(jìn)行比較。如果發(fā)現(xiàn)結(jié)果隨照明而變化，則此處認(rèn)為在自然光或人工日光下獲得的結(jié)果是正確的。此時可以使用合適的儀器方法代替目視法進(jìn)行測定），即當(dāng)一定條件下的測試結(jié)果存在爭議時，應(yīng)使用儀器法對溶液顏色進(jìn)行測定。
介紹完四大藥典中溶液顏色檢查法中目視法的區(qū)別，接下來我們對中國藥典和美國藥典當(dāng)中溶液顏色檢查的儀器法進(jìn)行分析。
在目視法觀察溶液顏色差異的過程中，人的主觀因素對決定判定結(jié)果起到了很大的作用，而儀器法則能提供更多的客觀數(shù)據(jù)，以彌補(bǔ)人眼觀察的不足。
其中紫外-可見分光光度法的測試原理為：當(dāng)光穿過被測物質(zhì)溶液時，物質(zhì)對光的吸收程度隨光的波長不同而變化。
藥典 | 中國藥典 | 美國藥典 |
操作方法 | 除另有規(guī)定外，取各供試品項下規(guī)定量的供試品，加水溶解并使成l0 ml, 必要時濾過，濾液照紫外-可見分光光度法通 (則0401)于規(guī)定波長處測定，吸光度不得超過規(guī)定值。 | 在紫外-可見光譜法<857>下討論的注意事項也適用于儀器顏色測量。在分光光度法中，在整個可見光譜（380 nm-770 nm）的離散波長處獲得反射率或透射率值，使用10 nm或更小的帶寬進(jìn)行檢測，以計算三刺激值。 |
色差計法的工作原理簡單地說即是模擬人眼的視覺系統(tǒng)，利用儀器內(nèi)部的模擬積光學(xué)系統(tǒng)，把光譜光度數(shù)據(jù)的三刺激值X、Y、Z進(jìn)行積分而得到顏色的數(shù)學(xué)表達(dá)式，從而計算出 L*（明度指數(shù)）、a*（色品指數(shù)）、b*（色品指數(shù)）值及對比色的色差ΔE*。
藥典 | 中國藥典 | 美國藥典 |
校準(zhǔn)方法 | 在每次測量時，按儀器要求 ，需用水對儀器進(jìn)行校準(zhǔn)，并規(guī)定水在D65為光源，10°視場條件下，水的三刺激值分別為：X=94.81；Y=100.00； Z=107.32 | 對于透射率測量，可將純化水用作白色標(biāo)準(zhǔn)，并規(guī)定所有波長的透射率為1.000。然后CIE光源C下的三刺激值X、Y和Z分別為98.0、100.0和118.1。 |
測量方法 | 使用具備透射測量功能的測色色差計進(jìn)行顏色測定，照明觀察條件為0/0(垂直照明 /垂直接收）條件；D65 光源照明，10°視場條件下，可直接測出三刺激值 X、Y、Z，并能直接計算給出L*、a*、b*和 △E*。 因溶液的顏色隨著被測定的溶液液層厚度而變，所以除另有規(guī)定外，測量透射色時，應(yīng)使用1cm厚度的液槽 。 | 對于透明液體光譜透射率的測量，試樣從法線的5°范圍內(nèi)照射到其表面，測量的透射能限制在法線的5°范圍內(nèi)。溶液的顏色隨測量層的厚度而變化。除非特殊考慮另有規(guī)定，否則應(yīng)使用1 cm厚的層。
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結(jié)果判定 | 除另有規(guī)定外，用水對儀器進(jìn)行校準(zhǔn)，取按各品種項下規(guī)定的方法分別制得的供試品溶液和標(biāo)準(zhǔn)比色液，置儀器上進(jìn)行測定，供試品溶液與水的色差值△E*應(yīng)不超過標(biāo)準(zhǔn)比色液與水的色差值△E* 。 如品種正文項下規(guī)定的色調(diào)有兩種，且供試品溶液的實際色調(diào)介于兩種規(guī)定色調(diào)之間，難以判斷更傾向何種色調(diào)時，將測得的供試品溶液與水的色差值)與兩種色調(diào)標(biāo)準(zhǔn)比色液與水的色差值的平均值比較，不得更深[△E*≤(△E*s1 +△E*s2)/2]。 | 工具變量可以影響結(jié)果。雖然可以在同時測量的類似顏色之間進(jìn)行可靠的比較，但在不同儀器或不同操作條件下獲得的結(jié)果應(yīng)謹(jǐn)慎進(jìn)行比較。如果有必要比較從不同儀器獲得的數(shù)據(jù)或在不同時間獲取的數(shù)據(jù)，對比參考材料上的讀數(shù)有助于識別儀器性能引起的變化。
|
備注 | 由于渾濁液體、黏性液體或帶熒光的液體會影響透射，故不適宜采用色差計法測定。 | 此法不適用于朦朧液體。 |
經(jīng)過對中國藥典、美國藥典、歐洲藥典以及日本藥典中的溶液顏色檢查規(guī)范的梳理，我們可以看到：
1、目視法是這四大藥典中普遍記載的檢查方法，說明這種方法的使用具有普遍性。
2、在中國藥典和美國藥典中也明確指：出當(dāng)溶液顏色很相近，目視法難以區(qū)分或辨別時，應(yīng)采用色差計法（儀器法）進(jìn)行檢測，以獲得更加準(zhǔn)確的測試結(jié)果，表明使用儀器測量溶液顏色可能是一個發(fā)展趨勢。
3、可以注意到如果樣品溶液渾濁、粘度大或者帶有熒光效應(yīng)時，會影響到樣品的透射測量，此時不適宜于用色差計法進(jìn)行檢測，所以在進(jìn)行溶液顏色檢查的時候，我們應(yīng)選取合適的方法將進(jìn)行檢測。
另外，由于這四大藥典中的溶液顏色檢查的參考標(biāo)準(zhǔn)不一樣，所以不建議隨便套用。現(xiàn)在大家是否對中國藥典、美國藥典、歐洲藥典以及日本藥典中的溶液顏色檢查規(guī)范的異同之處有了明確的把握呢？如有不當(dāng)之處，敬請指正。
解決方案：
上海胤煌科技針對藥劑的溶液顏色檢查推出了下列產(chǎn)品：
1、Qz-82a溶液顏色檢查專用傘棚燈
此溶液顏色檢查專用傘棚燈是專門針對于目視法溶液顏色檢查推出的設(shè)備，擁有日光型COB集成LED光源，在完成溶液顏色檢查的同時，可以減少光源對眼睛的刺激。另外，此儀器可以同時實現(xiàn)水平角度和垂直角度的溶液觀察，能有效簡化操作，更快得到對比結(jié)果。
2、YH-COS-0101溶液顏色檢查分析儀
此儀器采用D65組合LED光源對液體溶劑進(jìn)行透射式測量，儀器不僅具有傳統(tǒng)的色度色差測量，同時內(nèi)置中國藥典標(biāo)準(zhǔn)比色液庫，可以選配歐洲藥典或美國藥典比色數(shù)據(jù)庫，可以直接測量出待測溶液的色號。
1、 中國藥典（2020版）
2、 美國藥典（40版）
3、 歐洲藥典（10.0版）
4、 日本藥典（17版）
為了方便參考，以下給出各國藥典的比色液的配置方法：
比色用重鉻酸鉀液 精密稱取在120 °C 干燥至恒重的基準(zhǔn)重鉻酸鉀0.4000 g，置500 ml量瓶中，加適量水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。每l ml溶液中含0.800 mg的K2Cr2O7。
比色用硫酸銅液 取硫酸銅約32.5 g，加適量的鹽酸溶液(1-40)使溶解成500 ml，精密量取10 ml，置碘量瓶中，加水50 ml、醋酸 4 ml與碘化鉀2 g，用硫代硫酸鈉滴定液(0.l mol/L)滴定，至近終點時，加淀粉指示液2 ml，繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失。每 l ml硫代硫酸鈉滴定液(0.l mol/L)相當(dāng)于24.97 mg的CuS04·5H2O。根據(jù)上述測定結(jié)果，在剩余的原溶液中加適量的鹽酸溶液(1-40)，使每l ml溶液中含62.4 mg 的 CuS04·5H2O，即得。
比色用氯化鈷液 取氯化鈷約32.5 g，加適量的鹽酸溶液(1-40)使溶解成500 ml，精密量取2 ml，置錐形瓶中，加水200 ml，搖勻，加氨試液至溶液由淺紅色轉(zhuǎn)變至綠色后，加醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH 6.0)10 ml，加熱至60 °C，再加二甲酚橙指示液5滴，用乙二胺四醋酸二鈉滴定液 (0.05 mol/L)滴定至溶液顯黃色。每 l ml乙二胺四醋酸二鈉滴定液(0.05mol/L)相當(dāng)于11.90 mg 的 CoCl2·6H2O。根據(jù)上述測定結(jié)果，在剩余的原溶液中加適量的鹽酸溶液（1-40)，使每l ml溶液中含59.5 mg的CoCl2·6H2O，即得。
各種色調(diào)標(biāo)準(zhǔn)貯備液的制備 按表 1 精密量取比色用氯化鈷液、比色用重鉻酸鉀液、比色用硫酸銅液與水，混合搖勻，即得。
各種色調(diào)色號標(biāo)準(zhǔn)比色液的制備 按表2精密量取各色調(diào)標(biāo)準(zhǔn)貯備液與水，混合搖勻，即得。
氯化鈷比色溶液：將約65 g六水合氯化鈷（CoCl2·6H2O）溶解在25 mL鹽酸和975 mL水的混合液中，制成1000 mL溶液。用移液管將5 mL該溶液移入250 mL碘瓶中，加入5 mL過氧化氫和15 mL氫氧化鈉溶液（1/5），煮沸10分鐘，冷卻，并加入2 g碘化鉀和20 mL稀硫酸（1/4）。沉淀溶解后，用0.1 N硫代硫酸鈉溶液滴定釋放的碘，加入3 mL淀粉試液作為指示劑。使用相同量的相同試劑進(jìn)行空白組的測定，并進(jìn)行必要的校正。每毫升0.1 N硫代硫酸鈉溶液相當(dāng)于23.79 mg CoCl2·6H2O。通過添加足夠多的鹽酸和水的混合物來調(diào)整溶液的最終體積，使每毫升溶液含有59.5 mg CoCl2·6H2O。
硫酸銅比色液：將約65 g硫酸銅（CuSO4·5H2O）溶解在25 mL鹽酸和975 mL水的足夠混合物中，制成1000 mL溶液。用移液管將10 mL該溶液移到250 mL碘瓶中，加入40 mL水、4 mL醋酸、3 g碘化鉀和5 mL鹽酸，并用0.1 N硫代硫酸鈉溶液滴定釋放的碘，添加3 mL淀粉試液作為指示劑。使用相同數(shù)量的相同試劑進(jìn)行空白測定，并進(jìn)行必要的校正。每毫升0.1 N硫代硫酸鈉溶液相當(dāng)于24.97 mg CuSO4·5H2O。通過添加足夠的鹽酸和水的混合物來調(diào)整溶液的最終體積，使每毫升溶液含有62.4 mg CuSO4·5H2O。
三氯化鐵比色液：將約55 g三氯化鐵（FeCl3·6H2O）溶解在25 mL鹽酸和975 mL水的足夠混合物中，制成1000 mL。用移液管將10 mL該溶液移到250 mL碘瓶中，添加15 mL水、3 g碘化鉀和5 mL鹽酸，并使混合物靜置15分鐘。用100 mL水稀釋，用0.1 N硫代硫酸鈉溶液滴定釋放的碘，加入3 mL淀粉作為指示劑。使用相同數(shù)量的相同試劑進(jìn)行空白測定，并進(jìn)行必要的校正。每毫升0.1 N硫代硫酸鈉溶液相當(dāng)于27.03 mg FeCl3·6H2O。通過添加足夠的鹽酸和水的混合物來調(diào)整溶液的最終體積，使每毫升含有45.0 mg FeCl3·6H2O。
可根據(jù)附表制備字母標(biāo)識的流體顏色匹配標(biāo)準(zhǔn)。為制備所需的匹配液體，用移液管將規(guī)定體積的比色試驗溶液[參見“試劑、指示劑和溶液"一節(jié)中的“比色溶液（CS）"和水移入其中一個匹配容器中，并在容器中混合溶液。在前面描述的觀察條件下，按照各專題中的指示進(jìn)行比較。匹配液體或比色溶液的其他組合可在非常低的濃度下使用，以測量色度偏差。
黃色初級溶液。在約900 mL的鹽酸和975 mL的水中加入4.6 g六水合三氯化鐵，并用相同的混合物稀釋至1000.0 mL。通過添加相同的酸性混合物，滴定并調(diào)整溶液，使其每毫升含有45.0 mg FeCl3·6H2O。溶液避免光照。
滴定。將10.0 mL溶液、15 mL水、5 mL鹽酸和4 g碘化鉀放入裝有磨砂玻璃塞的250 mL錐形燒瓶中，關(guān)閉燒瓶，讓其在黑暗中靜置15分鐘，并添加100 mL水。用0.1 M硫代硫酸鈉溶液滴定釋放的碘。5 mL淀粉溶液，在滴定結(jié)束時加入，作為指示劑。
1 mL 的0.1 M硫代硫酸鈉溶液相當(dāng)于27.03 mg六水合三氯化鐵FeCl3·6H2O。
紅色初級溶液。將60 g二水合氯化鈷溶解在約900 mL的25 mL鹽酸和975 mL水的混合物中，并用相同的混合物稀釋至1000.0 mL。通過添加相同的酸性混合物，滴定并調(diào)整溶液，使其每毫升含有59.5 mg CoCl2·6H2O。
滴定。將5.0 mL溶液、5 mL稀釋過氧化氫溶液和10 mL 300 g/L氫氧化鈉溶液放入裝有圓形玻璃塞的250 mL錐形燒瓶中。輕輕煮沸10 min，冷卻后加入60 mL稀硫酸和2 g碘化鉀。關(guān)閉燒瓶，用0.1 M硫代硫酸鈉溶液輕輕搖動，溶解沉淀物，使用淀粉溶液，在滴定結(jié)束時添加，作為指示劑。當(dāng)溶液變成粉紅色時，即達(dá)到終點。
藍(lán)色初級溶液。將63 g五水硫酸銅溶解在約900 mL的25 mL鹽酸和975 mL水的混合物中，并用相同的混合物稀釋至1000.0 mL。通過添加相同的酸性混合物，滴定并調(diào)整溶液，使其每毫升含有62.4 mg CuSO4·5H2O。
滴定。將10.0 mL溶液、50 mL水、1.2 mL稀醋酸和3g碘化鉀放入裝有磨砂玻璃塞的250 mL錐形燒瓶中。用0.1 M硫代硫酸鈉溶液滴定釋放的碘，使用0.5 mL淀粉溶液，在滴定結(jié)束時添加，作為指示劑。當(dāng)溶液呈現(xiàn)輕微的淡棕色時，即達(dá)到終點。
1 mL的0.1 M硫代硫酸鈉溶液相當(dāng)于24.97 mg五水合硫酸銅CuSO4·5H2O。
使用3種初始溶液制備5種標(biāo)準(zhǔn)溶液，如下所示（表2.2.2.-1）：
方法1和2的參考溶液：
氯化鈷（II）CS：將65 g六水合氯化鈷溶解在25 mL鹽酸和水中，制成1000 mL。用移液管移取10 mL該溶液，加水精確至250 mL。用移液管移取25 mL溶液，加入75 mL水和50 mg多氯化鈉指示劑，然后滴加稀釋氨溶液（1/10），直到溶液顏色從紅紫色變?yōu)槌赛S色。在接近終點處添加0.2 mL稀釋氨溶液（1/10）后，用0.01 mol/L乙二胺四乙酸二鈉滴定，直到溶液顏色從黃色變?yōu)榧t紫色。
每毫升0.01 mol/L二氫乙二胺四乙酸二鈉相當(dāng)于2.379 mg六水合氯化鈷 CoCl2·6H2O。
根據(jù)滴定值，加入稀鹽酸（1/40），制成每毫升含有59.5 mg六水合氯化鈷（II）的溶液，并使用。將溶液儲存在玻璃塞瓶中。
硫酸銅（II）CS：將65 g五水合硫酸銅（II）溶解于25 mL鹽酸和水中，制成1000 mL。移液管取10 mL該溶液，加水至250 mL。移液管取25 mL該溶液，加入75 mL水，10 mL氯化銨溶液（3:50），2 mL稀釋氨溶液（1/10）和50 mg多氯化鈉化指示劑。用0.01 mol/L二氫乙二胺四乙酸二鈉滴定，直到溶液顏色從綠色變?yōu)樽仙?/span>
每1 mL的0.01 mol/L的二氫乙二胺四乙酸二鈉相當(dāng)于2.497 mg的五水合硫酸銅CuSO4·5H2O。
根據(jù)滴定值，加入稀鹽酸（1/40），制成每毫升含有62.4 mg五水硫酸銅（II）的溶液，并使用。將溶液儲存在玻璃塞瓶中
氯化鐵（III）CS：將55 g六水合三氯化鐵溶解在25 mL鹽酸和水中，制成1000 mL溶液。用移液管將10 mL該溶液移到碘瓶中，加入15 mL水和3 g碘化鉀，塞緊瓶塞，在黑暗處靜置15分鐘。向混合物中加入100 mL水，并用0.1 mol/L硫代硫酸鈉溶液（相當(dāng)于1 mL淀粉指示劑）滴定游離的碘。
每毫升0.1 mol/L硫代硫酸鈉溶液相當(dāng)于27.03 mg六水合三氯化鐵 FeCl3·6H2O。
根據(jù)滴定值，加入稀釋的鹽酸（1/40），制成每毫升含有45.0 mg六水合三氯化鐵（III）的溶液，并使用。將溶液儲存在玻璃塞瓶中。
根據(jù)表2.65-1的指示，使用滴定管或刻度小于0.1 mL的移液管精確測量三種比色儲備溶液和水的體積，并混合，制備顏色A至T的比色液。將溶液儲存在具塞玻璃瓶中。
對于B系列（B1至B9）、BY系列（BY1至BY7）、Y系列（Y1至Y7）、GY系列（GY1至GY7）和R系列（R1至R7）的每一種比色液，首先按照表2.65-2的指示，通過混合三種比色儲備溶液來制備單獨顏色的主要比色液，然后按照表2.65-3中的指示混合相應(yīng)顏色的主要比色液，以制備所需的比色液。
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